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PCR反應實驗步驟及反應擴增問題情況分析
一、PCR反應完整實驗步驟
試劑準備?
所有試劑提前解凍，全程冰上操作，低速離心后使用。
按體系比例依次加入水、緩沖液、dNTPs、引物、模板DNA和Taq酶，常規體系為20-50微升。
分區操作，先在試劑區加完除模板外的組分，再移至模板區加入DNA，避免交叉污染。
溫度循環設置?
預變性：94-98℃加熱1-5分鐘，讓模板DNA雙鏈充分解開。
循環擴增：重復25-40個循環，每輪依次為95℃變性30秒、50-65℃退火30秒、72℃延伸1分鐘。
終延伸：最后72℃保溫5-10分鐘，確保所有擴增產物合成完整，結束后4℃暫存。
產物檢測?
配制1%左右的瓊脂糖凝膠，將擴增產物與DNA Marker依次點樣，120V電泳30分鐘。
紫外成像儀下觀察條帶，判斷是否得到目標大小的擴增片段。
二、常見擴增問題情況分析
無擴增條帶?
模板問題：模板中雜蛋白殘留、核酸降解或濃度過高/過低，需重新純化模板并調整用量。
試劑問題：Taq酶失活、引物降解或dNTPs失效，更換新批次試劑重新配制體系。
程序問題：預變性不充分、退火溫度過高導致引物無法結合，適當延長預變性時間、降低退火溫度。
非特異性擴增/條帶雜?
引物問題：引物設計不合理、存在非特異性互補序列，重新設計引物并優化濃度。
程序問題：退火溫度過低、循環次數過多，適當提高退火溫度、減少2-3個循環。
體系問題：酶用量過大，按說明書減半調整酶的加入量。
出現引物二聚體?
引物濃度過高，將上下游引物終濃度調整至0.1-0.3μM。
引物之間存在互補序列，重新設計引物避免3'端互補配對。
可使用熱啟動Taq酶，減少低溫下引物的非特異性結合。
循環次數過多導致產物過量降解，減少循環次數。
電泳條件不合適，調整電泳電壓不超過150V，控制電泳時間。
注：以上科研產品資料僅供參考！
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