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　　本生帶您了解、小分子化合物(熒光染料)

　　熒光染料是指吸收某一波長的光波后能發(fā)射出另一波長大于吸收光的光波的物質(zhì)。由于靈敏度高，操作方便，逐漸取代了放射性同位素作為檢測標(biāo)記，其廣泛應(yīng)用于熒光免疫，細(xì)胞染色等。熒光染料即可以單獨(dú)使用，也可以組合成復(fù)合熒光染料使用，用于染色體分析、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等相關(guān)研究。另有很多核酸染料在多色染色系統(tǒng)中是非常有用的復(fù)染劑，可作為背景對照，標(biāo)記細(xì)胞核使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系一目了然。

　　常用核酸染料

　　DAPI是結(jié)合富含A-T堿基對DNA序列的熒光染料。DAPI是一種能夠與DNA中大部分A，T堿基相互結(jié)合的熒光染料﹐常用于熒光顯微鏡觀測。因為DAPI可以透過完整的細(xì)胞膜﹐它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。當(dāng)DAPI與雙鏈DNA結(jié)合時，最大吸收波長為358nm，最大發(fā)射波長為461nm。DAPI的發(fā)射光為藍(lán)色，且DAPI和綠色熒光蛋白GFP或Texas Red染劑(紅色熒光染劑)的發(fā)射波長僅有少部分重疊，可以利用這項特性在單一的樣品上進(jìn)行多重?zé)晒馊旧?/p>

　　一般的，用于細(xì)胞核染色時，推薦的DAPI工作濃度為0.5-10μg/mL。

　　Hoechst 33342是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，它在嵌入雙鏈 DNA后釋放強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，對細(xì)胞的毒性較低。Hoechst 33342染色常用于細(xì)胞凋亡檢測，染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。Hoechst 33342也常用于普通的細(xì)胞核染色，或常規(guī)的DNA染色。Hoechst 33342的最大激發(fā)波長為346nm，最大發(fā)射波長為460nm;Hoechst 33342和雙鏈DNA結(jié)合后，最大激發(fā)波長為350nm，最大發(fā)射波長為461nm。

　　細(xì)胞凋亡檢測

　　JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時，JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時;JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光。線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細(xì)胞膜電位的下降,同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個檢測指標(biāo)。

　　活性氧檢測

　　DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。

　　ROS熒光探針-DHE

　　DHE是一種可滲透細(xì)胞的藍(lán)色熒光探針，是過氧化物指示劑，可用于檢測細(xì)胞內(nèi)superoxide radical anion，能有效地檢測活性氧類。這種染料可以自由地進(jìn)入細(xì)胞中，脫氫后成為Ethidium。DHE可以直接用于活細(xì)胞的標(biāo)記。DHE被活細(xì)胞攝入后，可以在細(xì)胞內(nèi)的超氧化物陰離子作用下脫氫，產(chǎn)生Ethidium。Ethidium可以和RNA或DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的超氧化物陰離子水平較高時，產(chǎn)生的Ethidium較多，紅色熒光就較強(qiáng)，反之則較弱。DHE本身為藍(lán)色熒光，最大激發(fā)波長為370nm，最大發(fā)射波長為420nm，脫氫后和RNA或DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光，最大激發(fā)波長為300nm，最大發(fā)射波長為610nm，實(shí)際觀察時也可以使用535nm作為激發(fā)波長。

　　一般的，用于細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子檢測時，DHE的常用濃度為1-10μM。

　　鈣離子濃度檢測

　　Fluo-3 AM是常用的檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針之一。它穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成 Fluo-3，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)luo-3若以游離配體形式存在時幾乎是非熒光性的，但是當(dāng)它與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，最大激發(fā)波長為506nm，最大發(fā)射波長為526nm。實(shí)際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm左右，發(fā)射波長為525-530nm。可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

　　其他染料

　　尼羅紅是一種親脂性的惡嗪類熒光染料，與脂類物質(zhì)結(jié)合并發(fā)出熒光，在激發(fā)波長530nm激發(fā)下，顯示強(qiáng)烈桔紅色熒光。常用于檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴。

　　Calcein-AM是一種可對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑，它穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。Calcein的激發(fā)和發(fā)射波長分別為490nm和515nm。Calcein-AM和PI經(jīng)常被結(jié)合用來作為活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色。

　　FITC是在熒光素的基礎(chǔ)上通過化學(xué)反應(yīng)增加(異)硫氰酸基團(tuán)得到的，硫氰酸基團(tuán)可以和生物活性物質(zhì)例如蛋白質(zhì)上的伯胺基團(tuán)反應(yīng)形成硫脲鍵，從而實(shí)現(xiàn)對生物活性物質(zhì)的熒光標(biāo)記。FITC能和各種抗體蛋白等物質(zhì)結(jié)合，通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可進(jìn)行定性、定位或定量的檢測。

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